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測定意義：

細胞色素P450酶是一組在外源物質(zhì)代謝中，尤其是藥物和毒物，具有重要作用的酶系。AND作為P450酶系的重要一員，相當于CYP3A4亞型，與藥物的去甲基化反應(yīng)密切相關(guān)。

測定原理：

AND催化氨基比林釋放甲醛，通過Nash比色法測定甲醛含量，即可計算出AND活性。

組成：

試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加100ml蒸餾水充分溶解。

試劑三：粉劑×1管，4℃避光保存。臨用前加入1ml無水乙醇，充分溶解。

試劑四：粉劑×1管，4℃保存。臨用前加入0.5ml蒸餾水，充分溶解。

試劑五：粉劑×1瓶，室溫保存。臨用前加蒸餾水4ml充分溶解。

標準液：液體×1瓶，-20℃保存。臨用前取1.5ml EP 管，加入10μl標準液，加990μl蒸餾水，混勻即為0.05 mmol/L標準甲醛溶液，4℃保存。

自備儀器和用品：

普通離心機，超速離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水、無水乙醇和冰。

粗酶液提取：

1、除去細胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約0.5g組織，加入1 ml試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃離心30min，取上清液轉(zhuǎn)入超速離心管。

2、粗制微粒體：4℃，100 000g，離心60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1ml試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。

4、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5 ml，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液，待測。該待測液需當天使用。

AND活性測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到412 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于37℃水浴中預(yù)熱30min。

3. 對照管：取1支EP管，加入10μl粗酶液，170μl試劑二，10μl試劑三，10μl蒸餾水，混勻后置于37℃水浴保溫30min；立即加入35μl試劑五，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入35μl試劑六，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min；取新的EP管，加入100μl上清液，100μl試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測定光吸收，記為A對照管。

4. 測定管：取1支EP管，加入10μl粗酶液，170μl試劑二，10μl試劑三，10μl試劑四，混勻后置于37℃水浴保溫30min；立即加入35μl試劑五，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入35μl試劑六，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min；取1支新EP管，加入100μl上清液，100μl試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測定光吸收，記為A測定管。

5. 標準管：取1支EP管，加入100μl標準品，100μl試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測定光吸收，記為A標準管。

注意：每個樣品都需要做對照管。

AND活性計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個酶活單位。

AND活性(nmol/min/mg prot) = C標準品× V標準品×（A測定管－A對照管）÷A標準管× 稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T

= 45×（A測定管－A對照管）÷A標準管÷Cpr。

（2）按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：37℃中每分鐘每克組織催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個酶活單位。

AND活性(nmol/min/g 鮮重 ) = C標準品×V標準品×（A測定管－A對照管）÷A標準管×稀釋倍數(shù)÷(V樣÷V樣總×W)÷T

= 45×（A測定管－A對照管）÷A標準管÷W。

C標準品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V標準品：500μl=0.0005 L；稀釋倍數(shù)：V反總÷V上清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；V樣：加入粗酶液體積，50μl=0.05ml；V樣總：提取液體積，0.5ml；T：催化反應(yīng)時間（min），30min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個酶活單位。

AND活性(nmol/min/mg prot) = C標準品×V標準品×（A測定管－A對照管）÷A標準管× 稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T

= 45×（A測定管－A對照管）÷ A標準管÷ Cpr。

（2）按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：37℃中每分鐘每克組織催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個酶活單位。

AND活性(nmol/min/g 鮮重) = C標準品×V標準品×（A測定管－A對照管）÷A標準管×稀釋倍數(shù)÷(V樣÷V樣總×W)÷T

= 45×（A測定管－A對照管）÷ A標準管÷W。

C標準品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V標準品：500μl=0.0005 L；稀釋倍數(shù)：V反總÷V上清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；V樣：加入粗酶液體積，50μl=0.05ml；V樣總：提取液體積，0.5 ml；T：催化反應(yīng)時間（min），30min。

注意事項：

1、粗酶液需在當日完成測定，如需保存，則向粗酶液提取步驟3的沉淀中加0.5ml 20%的甘油，分裝后，-80℃保存；

2、試劑三和試劑四需臨用前配制，如當天沒有用完，4℃避光保存，可用1周；

3、粗酶液可直接用于蛋白濃度測定，建議用BCA法測蛋白含量。