测定意义：

乙醇俗称酒精，是最常见的一元醇，在检测酒的质量、分析血液乙醇含量和果蔬品质判断中通常需要频繁、大量地检测乙醇含量。

1.乙醇是酒的主要成分，是衡量酒质量的重要指标之一。我国是世界上最早发明酿酒的国家，也是酒类产品消费大国，其消费量居世界之首。因此，快速、准确测定酒中乙醇含量，对于确保酒的质量和保护消费者的健康具有重大意义。

2.乙醇是中枢神经系统最基本的抑制物，如果乙醇被大量摄入，会不可逆抑制呼吸甚至导致死亡，血液中乙醇检测结果通常作为认定是否酒后驾驶或醉酒驾驶的依据。

3.乙醇是判断储藏过程中果蔬品质变化的重要指标，研究表明，适当的乙醇处理能够减少腐烂和减轻果蔬生理病害、延缓果蔬成熟和衰老进程，从而延长货架寿命。因此，简便、准确和快速测定果蔬中乙醇含量具有非常重要的意义。

测定原理：

乙醇在乙醇脱氢酶的催化下氧化脱氢生成乙醛，同时，NAD被还原生成NADH，NADH在1-mPMS的作用下使WST-8显橙黄色，通过450 nm下测定吸光值变化可测得乙醇含量。

组成：

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入15 ml试剂三充分溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

自备仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水。

乙醇提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：蒸馏水体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml蒸馏水），进行匀浆，8000g，25℃离心10min，取上清待测。

2. 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：蒸馏水体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml蒸馏水），超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）， 8000g，25℃离心10min，取上清待测。

3. 血清（浆）等液体样品：直接测定。

测定步骤：

1. 分光光度计预热30min以上，调节波长至450nm。

2. 工作液的配制：临用前按照样本数量，按以下比例配制工作液

3. 样本测定

按下表加入如下试剂

混匀后记录450nm下测定初始吸光值A1，和37℃避光孵育10min后的吸光值A2，计算

△A=A2-A1。

乙醇含量计算：

标准条件下测定回归方程为y = 0.0512x + 0.0055          R² = 0.9991；

x为乙醇含量（μmol/ml），y为吸光值差值△A。

1. 按照血清（浆）体积计算

乙醇含量（μmol/ml）= (△A-0.0055)÷0.0512

=19.5×(△A-0.0055)

2. 按照样品质量计算

乙醇含量（μmol/g鲜重）= [ (△A-0.0055)÷0.0512×V1]÷(W ×V1÷V2）

= 19.5×(△A-0.0055)÷W

3. 按照细菌或细胞密度计算

乙醇含量（μmol/10⁴ cell）= [ (△A-0.0055)÷0.0512×V1]÷（500×V1÷V2）

=0.039×(△A-0.0055)

V1：加入反应体系中样本体积，0.2ml；V2：加入提取液体积，1 ml； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；

注意事项：

测定前取1-2个样做预实验，若△A﹥0.6或乙醇含量﹥10μmol/ml，需将样本用蒸馏水稀释后再测定，以确保测定的准确性。

最低检测限：0.02μmol/ml。