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正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                             

測(cè)定意義：

DAO(EC1.4.3.6)廣泛存在于動(dòng)物（腸粘膜、肺、肝臟、腎臟等）、植物和微生物中。催化多胺氧化為醛，其活性與核酸和蛋白合成密切相關(guān)，能夠反映腸道機(jī)械屏障的完整性和受損傷程度。

測(cè)定原理：

DAO催化尸胺產(chǎn)生醛和過氧化氫，外源添加過量的辣根過氧化物酶，催化過氧化氫氧化鄰聯(lián)茴香胺生成氧化型鄰聯(lián)茴香胺，在460nm處有特征吸收峰，通過測(cè)定該波長(zhǎng)吸光度增加速率，計(jì)算DAO活性。

試劑組成和配制：

自備儀器和用品：

天平、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)、1 ml玻璃比色皿、蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1ml提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3、血清等液體：直接測(cè)定。

測(cè)定步驟：

混勻，37℃水浴30min，1ml玻璃比色皿，對(duì)照管調(diào)零，測(cè)定A₄₆₀

酶活性計(jì)算公式：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

DAO活性（nmol/min/mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 18×A460÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/g）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T= 18×A460÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/104cell）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量）÷T= 18×A460÷細(xì)胞數(shù)量

(4) 按液體體積計(jì)算

酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/ml）= ×V反總÷V樣÷T= 18×A460

ε：氧化型鄰聯(lián)茴香胺毫摩爾消光系數(shù)：7.5 L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)總體積，1ml；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.25ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；T：反應(yīng)時(shí)間，30min

注意事項(xiàng)：

1、如果OD值小于0.01，適當(dāng)加大提取用的樣本質(zhì)量； OD值大于0.8，粗酶液可適當(dāng)稀釋，或者減少提取用樣本量。

2、樣品蛋白質(zhì)含量需要另外測(cè)定。