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產品信息

 1.產品概述

免疫共沉淀Co-IP（Co-Immunoprecipitation）是基于抗體和抗原之間結合的專一性用于研究蛋白質相互作用的經典方法。其原理是細胞在非變性條件下被裂解時，細胞內存在的蛋白質與蛋白質相互作用體被保留下來，然后利用目標蛋白質特異性抗體進行免疫沉淀。沉淀得到的蛋白質復合體能夠通過變性凝膠電泳分離開來，以此定性或定量分析幾種蛋白質間相互作用。

2.試劑

3.材料

 Poly Mac Tips  35個

4.實驗步驟

1. 蛋白提取

1) 細胞樣本

1 洗滌：預冷的 1 ml  1×PBS 洗滌樣品（約 1×10⁷個細胞）2 次，最后一次吸干 1×PBS；

2 裂解：根據(jù)細胞量加入 1 ml Cell lysis buffer、10 ul Protease inhibitors，冰上充分裂解 20~30 min，期間顛倒混勻 3 次，再超聲3次，每次5 sec。

3 離心：4℃，13000 g，15 min，收集上清；

4 測BCA，將收集的上清用Cell lysis buffer稀釋到1ug/ul。

2) 組織樣本

1 研磨：取新鮮組織或深低溫組織（不少于 0.3g），置于研缽中，用液氮進行研磨，轉移組織粉末至新的 EP 管中；

2 裂解：加入 1 ml Cell lysis buffer、10 ul Protease inhibitors，冰上充分裂解 20~30min，期間顛倒混勻 3 次；

3 離心：4℃，13000 g，15 min，收集上清。

4 測BCA，將收集的上清用Cell lysis buffer稀釋到1ug/ul。

2.蛋白與抗體孵育

1 將步驟 1 得到的樣品，取 100 μL 作為 Input 組，取 900 μL 作為 IP 組，Input 組-80℃保存待用，IP 組管加入 2~5 μg 目的抗體；

2 4℃，垂直混勻器搖動孵育過夜。

（一般每個IP樣本需200-500μl細胞裂解物，濃度在1μg/μL左右，以下步驟以200μl細胞裂解物進行IP為例）

3. Protein-A/G 磁珠懸液準備

1 取 20 ul Protein A/G-Beads，4℃，瞬離棄上清；

2 加入 500 ul 預冷的Cell lysis buffer，混勻，瞬離棄上清，再重復洗滌 1 次；

3 用 100 ul 預冷的Cell lysis buffer 將 Protein A/G-Beads 配成懸液。

4. Protein-A/G 磁珠與抗體結合

1 取步驟 3 得到的 100 μL Protein A/G-Beads 懸浮液加入到 IP 組 EP 管中，4℃，垂直混勻器搖動 2~3 h；

5.洗滌、洗脫

1 將步驟 4 的 IP 組樣品，轉入 Poly Mac Tips中,500rpm,60 ses；

2 加入200ul Wash buffer I 轉IP樣品于 Poly Mac Tips中（盡量多的將IP樣品殘留轉移至 Poly Mac Tips中），500 rpm,1 min，再重復洗滌1次。

3 用 200ul Wash buffer II 轉IP樣品于 Poly Mac Tips中（盡量多的將IP樣品殘留轉移至 Poly Mac Tips中），500 rpm,1 min，再重復洗滌1次；

4 棄過濾液，標記新的EP管待用，加入100 ul Elution buffer,500 rpm,40 sec。

5 在收集的樣品中加入10 ul Neutralization buffer。

6 重復4、5步驟，收集220ul樣品，殘余用注射器吹入EP管，渦勻離心，-80℃保存待用。

5. 質譜檢測（選擇一）

6. western blot（選擇二）

8.注意事項

本產品Protease inhibitor 對人體有毒，操作時要特別小心，并注意有效防護以避免直接接觸人體或吸入體內；

本產品僅限于專業(yè)人員的科學研究使用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

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